一、什么是疏水色譜？

? 蛋白等大分子電解質(zhì)在不含鹽的水溶液中，由于同種電荷會(huì)發(fā)生靜電相互排斥作用，因此溶解度不高。添加鹽會(huì)削弱靜電排斥作用并提高溶解度，即所謂salt in（鹽溶）現(xiàn)象。進(jìn)一步提高鹽濃度，與蛋白結(jié)合（水和）并穩(wěn)定其溶解的水會(huì)被鹽奪走。其結(jié)果是，被水和覆蓋的疏水部位露出，引起彼此之間的疏水相互作用并開始沉淀，即所謂salt out（鹽析）現(xiàn)象。在疏水色譜中，使用高濃度鹽的流動(dòng)相，在導(dǎo)入了疏水性官能團(tuán)的填料和分析樣品之間產(chǎn)生疏水性相互作用，使得樣品組分結(jié)合到填料上。其后，逐漸降低鹽濃度，疏水性相互作用減弱，分析樣品從填料中被洗脫出來(lái)。分析樣品不同組分其相互作用的程度不同，因此，可在不同鹽濃度下發(fā)生洗脫。氨基酸組成和立體結(jié)構(gòu)是決定疏水性的重要原因，同時(shí)疏水相互作用和分子尺寸之間也有較弱的關(guān)聯(lián)。一般而言，分子量越大，疏水相互作用表現(xiàn)出越強(qiáng)（＝洗脫遲緩）的趨勢(shì)。

二、色譜柱（填料）的選擇

?官能團(tuán)的種類和疏水性的強(qiáng)弱如下圖所示。雖然疏水性的強(qiáng)弱基本取決于官能團(tuán)，但還是會(huì)受到鍵合密度的影響，密度越高，疏水性越高。另外，芳香族官能團(tuán)和脂肪族官能團(tuán)，受π電子引起的相互作用的影響，選擇性上存在略微差異。

? 考慮分析樣品向孔內(nèi)部的滲透、擴(kuò)散引起的傳質(zhì)效應(yīng)，一般選擇較大孔徑的（例如，約100 nm）填料。但在純化過(guò)程中，考慮到效率，有時(shí)也會(huì)選擇對(duì)實(shí)際分析樣品吸附載量最大所對(duì)應(yīng)孔徑的填料。TOYOPEARL Phenyl-600、PPG-600、Butyl-600等600系列的孔徑設(shè)計(jì)為75 nm左右，大多用于分子尺寸與抗體相同或類似的分析樣品的純化。TOYOPEARL Butyl-550的孔徑設(shè)計(jì)得較小，約為50 nm，適用于小分子蛋白和肽的純化。疏水色譜中使用的基質(zhì)如下表所示。非多孔性填料是在無(wú)孔聚合物基質(zhì)填料表面導(dǎo)入了疏水官能團(tuán)的高速、高分辨率用填料。無(wú)需考慮向孔內(nèi)的擴(kuò)散，因此適用于所有分子尺寸的分析樣品。然而非多孔性填料的有效表面積較小，導(dǎo)致樣品載量較少，同時(shí)還需要注意雜質(zhì)可能造成的污染。

?使用梯度洗脫時(shí)，色譜柱長(zhǎng)度對(duì)分辨率的影響較小，不需要為了提高分辨率而增大色譜柱長(zhǎng)度。另一方面，在吸附載量較重要的純化工藝中，色譜柱長(zhǎng)度則對(duì)動(dòng)態(tài)吸附載量有影響。特別在高流速條件下使用長(zhǎng)度較短的色譜柱時(shí)，由于動(dòng)態(tài)吸附載量較低，需要考慮處理能力時(shí)，最好采用相同的色譜柱長(zhǎng)度（或柱床高度）或至少10 cm以上長(zhǎng)度的色譜柱進(jìn)行規(guī)模放大研究。

疏水色譜用填料基質(zhì)的種類和特點(diǎn)

三、流動(dòng)相的選擇

?在疏水色譜中，緩沖液的種類對(duì)選擇性幾乎沒(méi)有影響。大多推薦使用在中性附近具有緩沖能力的20~100 mmol/L左右的磷酸鹽緩沖液或Tris鹽酸鹽緩沖液，加入1~2 mol/L左右的硫酸銨作為流動(dòng)相使用。硫酸銨價(jià)格低廉，水溶解度高，在低溫條件下，溶解度也不會(huì)下降。由于選擇性的不同，有時(shí)也使用硫酸鈉或氯化鈉。但硫酸鈉在低溫下溶解度會(huì)大幅下降，需要注意鹽析現(xiàn)象。

?初始鹽濃度設(shè)定為分析樣品不會(huì)發(fā)生沉淀的鹽濃度。通常情況下，預(yù)先配制添加了多種濃度的硫酸銨（1~2 mol/L）樣品，將上清液和沉淀物分別使用SDS-PAGE等，計(jì)算分析樣品不發(fā)生沉淀的最高硫酸銨濃度，以該濃度作為初始流動(dòng)相的鹽濃度。盡量使用高鹽濃度的初始流動(dòng)相，鹽析沉淀的雜質(zhì)可以事先通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾和離心法去除。

?分析樣品的疏水性較高時(shí)，即使降低鹽濃度，也無(wú)法洗脫，或峰形展寬。此時(shí)，推薦可將少量的水溶性有機(jī)溶液（例如，異丙醇等）添加到鹽濃度較低的流動(dòng)相中。在疏水色譜中，使用鹽濃度較高的流動(dòng)相，因此，添加有機(jī)溶劑時(shí)，要注意鹽的析出。另外，添加有機(jī)溶劑，色譜柱壓力會(huì)升高，因此還需注意壓力上升，根據(jù)需要調(diào)整流速。

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四、分離示例

1.?標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分離示例

? 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分離示例如下圖所示。大多情況下，流動(dòng)相使用磷酸鹽緩沖液（pH?7.0）。

2.?PEG 化蛋白的分離

?導(dǎo)入PEG，疏水性會(huì)增大，因此可以觀察到與PEG導(dǎo)入數(shù)相對(duì)應(yīng)的色譜峰。下圖顯示了在木瓜蛋白酶水解后的人抗體片段（Fab）中使用PEG-N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）衍生物制作的PEG化Fab的分析示例。

3.?抗體藥物的分離

? 抗體異構(gòu)體的分離大多使用陽(yáng)離子交換色譜，但使用疏水色譜，可以得到選擇性與離子交換色譜不同的結(jié)果。5種市售抗體藥物的異構(gòu)體分析示例如下圖所示。每種抗體都分離出了多個(gè)色譜峰。

4.?ADC（Antibody-drug conjugate）的分離

? ?ADC是將抗體和小分子藥物偶聯(lián)到一起的藥物?？贵w對(duì)癌細(xì)胞等表面存在的抗原進(jìn)行識(shí)別/結(jié)合，被吸收到細(xì)胞內(nèi)后，在細(xì)胞內(nèi)部與抗體結(jié)合的藥物顯示出藥效，可以選擇性地只殺死特定細(xì)胞。通常1個(gè)抗體偶聯(lián)3~4個(gè)小分子藥物。未偶聯(lián)藥物的抗體雖然也與抗原結(jié)合，但無(wú)小分子藥物藥效，只有作為抑制劑發(fā)揮作用的可能。相反，過(guò)多偶聯(lián)小分子藥物時(shí)，與抗原的結(jié)合能力下降，因此不建議使用。在 ADC質(zhì)量管理中，關(guān)于對(duì)藥物引入程度（即DAR：Drug to Antibody Ratio）的評(píng)價(jià)非常重要。

? 在ADC中，采用了使用抗體攜帶的氨基和還原SS結(jié)合生成的巰基導(dǎo)入藥物的方法。由于大多藥物的疏水性較高，因此，測(cè)定ADC中的藥物偶聯(lián)量時(shí)，一般采用疏水色譜。使用TSKgel Butyl-NPR分析ADC的示例如下圖所示。分析結(jié)果表明，二硫鍵還原后生成的巰基與藥物很好地偶聯(lián)上了。