? ? ?有人問到：“我的工藝是流穿模式，是否需要評價柱效？”還有人問到：“我的工藝是親和層析，單梯度洗脫，不用擔(dān)心拖尾，是否需要評價柱效？”今天，小編為大家進行統(tǒng)一解答。
什么是柱效？
? ? ?柱效（column efficiency），是指層析柱保留某一物質(zhì)而不使其擴散的能力。柱效越高，則分離度越高。
塔板理論及柱效評價標(biāo)準(zhǔn)
? ? ? 馬?。∕artin）和欣革（Synge）最早提出塔板理論，將層析柱比作蒸餾塔，把一根層析柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間為固定相占據(jù)，另一部分空間充滿流動相。組分隨流動相進入層析柱后，就在兩相間進行分配。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達到分配平衡，這樣一個小段稱作一個理論塔板（theoretical plate）。經(jīng)過多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分先離開蒸餾塔，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。
理論塔板數(shù)（N）計算公式：
? ? ? 該公式中的Ve，必須從進樣時起算。
? ? ??每米理論塔板數(shù)（N/m）=理論塔板數(shù)（N） ÷ 柱床高度。
? ? ? HETP（height equivalent of theoretical plate），理論塔板等量高度，即每一層理論塔板的高度。
? ? ? 簡單來說，每米理論塔板數(shù)，是指每米有多少層；HETP，是指每一層有多高?？梢哉f兩者是互為倒數(shù)的關(guān)系。
? ? ?評價標(biāo)準(zhǔn)：一般情況下，認(rèn)為HETP ＜4倍粒徑大小即為比較理想的柱效。比如裝填平均粒徑90 μm的Sepharose填料，則要求HETP ＜360 μm，通過計算，要求每米理論塔板數(shù) ＞2778?；蚩筛鶕?jù)實際情況，將柱效標(biāo)準(zhǔn)定為每米理論塔板數(shù) ≥3000。
對稱性，也稱峰不對稱因子（Asymmetry, As），用來評價層析柱裝填的均勻程度。
? ? ??As?=b/a。As ＞1，說明裝填偏松，表現(xiàn)為峰拖尾；As ＜1，說明裝填偏緊，表現(xiàn)為峰前沿。若對分離度有較高要求，可把標(biāo)準(zhǔn)定為0.8 ＜As ＜1.2；若對分離度要求并不高，可把標(biāo)準(zhǔn)定為0.8 ＜As ＜1.5，甚至更寬的范圍。
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是否一定要評價柱效？
? ? ? 總體來說，還是建議進行柱效評價的，但柱效評價標(biāo)準(zhǔn)不能一概而論。
? ? ??高標(biāo)準(zhǔn)：1）分子篩層析；2）反相層析；3）疏水層析；4）采用階性梯度或線性梯度洗脫的離子交換層析。此類層析對分離度有較高要求，有些需要采用多梯度洗脫或線性洗脫，如果柱效不佳，往往會造成峰擴散或拖尾，會對純化效果產(chǎn)生很大影響。建議標(biāo)準(zhǔn)：HETP ＜4倍粒徑，0.8 ＜As ＜1.2。
? ? ? 低標(biāo)準(zhǔn)：1）親和層析；2）采用單梯度洗脫的離子交換層析。此類層析僅需采用單梯度洗脫，有時在產(chǎn)物洗脫下來后，還要立即進行稀釋，以防產(chǎn)物聚集，因此對分離度要求較低。然而，過于嚴(yán)重的峰擴散和拖尾，也是會影響純化效率的，因此柱效測定也必不可少。建議標(biāo)準(zhǔn)：HETP ＜5倍粒徑，0.8 ＜As ＜1.5。
? ? ? 僅要求峰型及對稱性：流穿模式。此類模式為目標(biāo)產(chǎn)物流穿，雜質(zhì)被吸附，如果填料裝填不均勻，或者過于松散，仍會導(dǎo)致吸附不勻而影響載量和處理量。因此，評估柱效時建議觀察一下峰型及對稱性，如果峰型平滑，且對稱性良好，即可接受。建議標(biāo)準(zhǔn)：0.8 ＜As ＜1.5。當(dāng)然，如果裝填工藝穩(wěn)定，甚至進行了工藝驗證，該模式也可以不進行柱效評價。
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柱效評價的常見問題及處理
前沿峰
可能原因：壓縮過緊。
解決辦法：重新裝填。
拖尾峰
可能原因：1）壓縮過松；2）管路過粗，或檢測器流通池體積過大，造成稀釋效應(yīng)。
解決辦法：1）重新裝填；2）檢查管路及檢測器流通池規(guī)格是否匹配。
低柱效
? ? ? 可能原因：1）沉降不均勻；2）碎填料過多；3）檢測器或泵故障。
? ? ??解決辦法：1）降低勻漿濃度，確保攪拌均勻后一次性緩慢倒入層析柱；2）去除碎填料；3）檢查檢測器及泵是否正常；4）考慮更換為粒徑更細(xì)的填料以提高柱效，如TOSOH聚合物基材填料（http://zhudiban.cn/brand/view/1.html）。
峰型不佳
? ? ? 可能原因：1）柱床中心凹陷，或柱床與篩網(wǎng)之間存有氣泡，導(dǎo)致樣品流動不均勻（樣品需要繞過凹陷區(qū)或氣泡）；2）裝填不均勻，甚至內(nèi)部有裂縫；3）篩網(wǎng)堵塞，導(dǎo)致樣品流動不均勻；4）層析柱無分配器，或分配器設(shè)計不佳，導(dǎo)致偏流。
? ? ??解決辦法：1）重新裝柱，優(yōu)化裝柱策略；2）拆卸、清洗篩網(wǎng)，并確認(rèn)篩網(wǎng)孔徑是否合適；3）采用具有合理分配器設(shè)計的層析柱。
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