Sephadex G-type 凝膠過(guò)濾填料
GE 的 Sephadex 系列的凝膠過(guò)濾填料是珠狀凝膠,它是葡聚糖和環(huán)氧丙烷偶聯(lián)介質(zhì),擁有極高的選擇性。 不同型號(hào)具有不同分離范圍,顆粒大小不同。粗顆粒流速較快,細(xì)顆粒流速較慢,分辨率較高。
其主要應(yīng)用在低和高分子量分子間的分離。常常應(yīng)用于脫鹽、緩沖溶液的置換、去除一些生物大分子中的小分子,例如兩性電解物、去垢劑、放射性熒光標(biāo)記物、苯酚等等。
操作技術(shù)信息
1、洗脫液的選擇:
?洗脫液不會(huì)直接影響分辨率。
?為了避免離子的影響,洗脫液的離子強(qiáng)度應(yīng)該至少是 0.15M
?選擇的洗脫液要為樣品蛋白提供很好的溶解性和穩(wěn)定性。
?選擇合適的洗脫液常常能夠簡(jiǎn)化后續(xù)的分離步驟。例如,為了后續(xù)的離子交換層析,可用開(kāi)始的緩沖溶液平衡柱子。
2、洗脫液的準(zhǔn)備
?使用色譜級(jí)或分析級(jí)溶劑,鹽,和緩沖液
?用清潔玻璃器皿配制并存儲(chǔ)洗脫液
?洗脫液可用 0.22 μ m 的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾而且在使用前最好脫氣。
?不使用時(shí)在 4 ℃條件下存儲(chǔ)洗脫液,為了防止細(xì)菌生長(zhǎng),可以添加抗菌劑。
?低溫存儲(chǔ)的洗脫液應(yīng)放至室溫后再使用,以防止產(chǎn)生氣泡(如果在使用前洗脫液已儲(chǔ)存,建議可先除去氣體)
3、樣品制備
?當(dāng)使用的填料粒徑范圍為10-15 μ m時(shí),樣品量≤0.5%柱體積;當(dāng)填料粒徑范圍為30-100μ m時(shí),上樣量≤5%柱體積。
?在組分分離時(shí),比如脫鹽,上樣量可達(dá)到 30 %柱體積。
?當(dāng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí),采用相同的方法制備樣品,保持樣品的濃度和體積不變。
?選擇的層析條件要保證樣品是穩(wěn)定的和可溶的。
?通過(guò)離心(例如,10 000g 離心 10min)或過(guò)濾去除樣品中的微粒(如果樣本是溶解在有機(jī)溶劑,一定要選擇耐有機(jī)溶劑的過(guò)濾器)
?如果樣品有較高的粘度,用洗脫液進(jìn)行稀釋。(避免大于 30mg 蛋白/ml 樣品)
?在低溫下存儲(chǔ)樣品,除非這導(dǎo)致樣品析出或沉淀;避免長(zhǎng)期存儲(chǔ),除非可以存儲(chǔ)在-70℃
?使用蒸餾水
?使用色譜級(jí)或分析級(jí)溶劑,鹽,和緩沖液。
4、實(shí)現(xiàn)分離最優(yōu)化?
?樣品量—上樣量越少,分辨率越高。
?流速—高分子量物質(zhì)(蛋白質(zhì)),較低的流速有更好的分辨率。但對(duì)于低分子量物質(zhì)(小肽)與其相反。因?yàn)樗麄償U(kuò)散速度較快,所以分離時(shí)間越長(zhǎng),樣品擴(kuò)散區(qū)域越廣。
?柱長(zhǎng)度—將兩個(gè)柱子串聯(lián),可提高有效柱床高度。
?緩沖液的選擇和 pH 值通常影響較弱。然而,低 pH 值可提高疏水相互作用,在某些情況下常常能改善物質(zhì)分離(如肽類混合物的分離)